［文献解读］免疫组库检测提示CTLA-4单抗治疗肿瘤的效果

Improved Survival with T Cell Clonotype Stability After Anti–CTLA-4 Treatment in Cancer Patients
Sci Transl Med. 2014 May 28;6(238):238ra70 IF:16.26

摘要
概述：用独有的TCR克隆类型的数目表征TCR的多样性，CTLA-4抗体治疗增加TCR多样性，并且，历时数月的治疗过程中克隆类型组库持续演化。然而，治疗时克隆类型增加的数目与临床表现无关。总体生存率的提高与治疗前高频克隆的稳定维持相关；反之，高频克隆治疗后频率下降的患者总体生产率低。维稳的克隆类型包含具有高亲和力TCR的T细胞，如，病毒响应T细胞。
亮点: 本研究通过基于高通量测序的免疫组库检测对TCR组库与CTLA-4阻断治疗的关系进行了研究，结果提示CTLA-4阻断引起T细胞组库样和多样化；并且，较好的治疗效果与减少克隆类型丢失、维持高频TCR克隆的存在正相关。
意义： 免疫组库检测发现了治疗前高频克隆的维稳与治疗效果好坏密切相关，表现出预测治疗效果的作用；进一步研究发现这些维稳的高频克隆可能原本就是具有抗肿瘤作用的高亲和力T细胞，部分揭示了CTLA-4可能的作用机制。
背景
1.CTLA-4单抗治疗癌症的效果很好，但机制仍未充分阐明。目前主要的机制研究集中在特异性抗原导向的响应、或者T细胞亚群的免疫表型变化，还没有对整个T细胞组库的研究。
2.目前进入临床三期的两个 CTLA-4单抗 ipilimumab和tremelimumab， ipilimumab已被FDA批准用于转移性黑色素瘤的治疗。两个药物应用时，均倾向于表现出稳定或客观缓解延迟的现象，难以判断效果；此外，具有免疫毒性和破坏多个器官的自身免疫耐受的副作用，因此，急需预测药物疗效的标志物，以提高临床受益。
3.研究表明治疗前基线T细胞的状态似乎对于能否从CTLA-4单抗 ipilimumab 的疗效至关重要，对治疗响应的效应T细胞可能不是重新产生的，而是倾向于之前就存在的肿瘤特异性T细胞克隆，已由APC递呈了肿瘤抗原，只是被随后的CTLA-4信号通路所抑制，这一假说有待验证。
方案设计
样品： 外周血单核细胞（PBMCs）
入组患者：
25例转移性去势抗性前列腺癌患者，ipilimumab+GM-CSF治疗，1/2期临床试验，每4周治疗一次；
21例转移性黑色素瘤患者，tremelimumab治疗，2期临床试验，每12周治疗一次；
9例健康对照，不做任何治疗。
检测方法：基于多重PCR和NGS的高通量免疫组库技术，检测灵敏度：频率 10-6
阻断CTLA-4重塑了T细胞受体（TCR）组库

CTLA-4抗体的使用引起T细胞组库的演化：
1.与未进行治疗的对照相比，每个接受了一次CTLA-4单抗治疗的患者均存在绝对数量增加和数量减少的T细胞克隆。
2.用Morisita’s distance衡量治疗前后T细胞克隆的变化程度，与未处理组相比，前列腺癌患者和黑色素瘤患者治疗前后均呈现显著变化。
阻断CTLA-4影响TCR组库的多样性

采用组库大小作为衡量多样性的标准，即按分子数排名前25%的克隆种类的数目；

然后，治疗后与治疗前（1个月治疗1次）相比，得到组库大小变化倍数。

与健康对照相比，治疗组组库多样性增加：

1. 45%（34/76）的CPRC样本和57%（12/21）黑色素瘤样本TCR多样性变化倍数超过2倍。

2. 总体患者中的47%（46/97），多样性变化超过2倍。

3. 9例未处理的健康人多样性的变化倍数全都不超过2倍。

4. 多样性变化倍数最高的是黑色素瘤样本，43%的大于10倍变化；CRPC患者只有9%大于10倍变化。

对治疗前后（治疗后4周/治疗前）T细胞克隆丰度显著变化的克隆类型进行了评估：
1.前列腺癌患者中，不同丰度的T细胞克隆类型中，有297种（中值）克隆丰度显著增加，134种（中值）克隆丰度显著降低；
2.黑色素瘤患者中，丰度增加的克隆远多于减少的（中值，213 vs 25）；
3.一个治疗周期（1个月）后，克隆丰度两个方向的变化远较对照组显著，提示阻断CTLA-4介导了TCR组库增加（turnover）。
以上数据显示，TCR组库的多样性增加主要是因为克隆种类增加超过克隆种类减少。
TCR组库在重复治疗过程中持续演化

问题1：持续的治疗对T细胞组库的影响？
设计： 13个前列腺癌患者接受了至少连续3个治疗周期（4周一个周期），考察每次治疗显著变化的克隆类型的数量。
结果： 只考虑unique克隆类型的丰度，两个方向均发生显著的变化。
问题2：组库的变化是重复给药的效果还是一次给药的持续效果？
设计：一个患者单次给药，3个月后检测；另一患者重复给药，3个月后检测。
结果： 单次给药组库变化显著不如重复给药。
小结：重复给药将不断地重塑TCR组库。
高频率T细胞克隆的维持可提高整体生存率

临床疗效与T细胞组库变化没有呈现相关性，因此考察了是否与克隆类型的变化有相关性：
1.对高频克隆（≥10-3）进行分析；
生存期短的患者治疗4周和8周的高频T细胞克隆类型与治疗前相比发生了显著的降低，P = 0.013 and P = 0.004；
临床有效的患者，高频T细胞克隆的类型没有发生显著变化， P = 0.695 and P = 0.096。
2.对TCR克隆类型变化与生存期的相关性进行分析，发现与生存期短的患者相比，生存期长的患者拥有较少的频率降低的T细胞克隆（ P = 0.006, P = 0.0281）。
治疗前激活的CD8 T细胞在治疗后生存期长的患者体内持续存在

考察了幼稚CD27+CD45RA+ CD8 T细胞和成熟（激活的效应细胞或记忆细胞） CD8细胞 对克隆类型变化的贡献：
1.仅有极少量的丰度变化的克隆属于幼稚CD8 T cells
2.用药后丰度变化大的克隆大多为成熟T cells
提示：治疗后得到缓解的患者之前就具备激活状态的细胞毒性T细胞，而不是由幼稚T细胞转化为激发状态。
抗原特异性的克隆亚型维持稳定可以反映TCR的亲和力
治疗前后稳定存在的高频率T细胞克隆其本质是什么？

1. 用MHC/肽段四聚体（ HLA-A*0201/pp65 peptide 四聚体）分离对特定抗原（巨细胞病毒，CMV）有响应的T细胞：
发现有一个病人（临床部分缓解，生存期56个月），仅由3种T细胞克隆就组成了80%的响应T细胞（B图），这3个T细胞克隆在治疗前后均维持较高的频率，直至4个治疗周期后（16周）依然很高。
其中频率最高的克隆CDR3氨基酸序列与之前报道的pp65特异性克隆一致。
2. 同样的方法鉴定到三个患者具有自身肽（ p1182和p1183 ）特异性克隆，但其存在均具有瞬时性，未能维持高频。
3.同时也考察了已知的肿瘤相关抗原，包括MART1(26–35)、tyrosinase(368–376)、gp100(209–217)、PSA和PAP，未检测到特异性克隆。
讨论
1.目前CTLA-4抗体治疗的作用机制有两种模型假说：1.阈值模型，CTLA-4阻断会引起低亲和力的T细胞克隆扩增、多样性增加；2.衰竭模型， CTLA-4阻断会促进高亲和力T细胞优先扩增，组库变窄。本研究的结果中T细胞组库多样性的变化与阈值模型一致，但也揭示了治疗前就存在的高频高亲和力T细胞的稳定存在与较好的总体生存率正相关，突显了治疗前抗肿瘤活性T细胞存在对于临床受益的重要性。
2.本研究不仅揭示了CTLA-4阻断的机制，更重要的是提出通过高通量免疫组库检测找出预测治疗效果的模式。
3.本研究中没能检测和分选到以往报道的肿瘤相关抗原特异性T细胞克隆，这与以往的假说一致——肿瘤患者会产生个性化的个人特有的肿瘤免疫响应，包括T细胞对肿瘤特异性的突变发生响应。
4.本研究中发现高频克隆类型减少的患者治疗效果差总体生存率低，可能反映了一类Teff细胞，与肿瘤抗原有强结合，但被检查点抑制剂所抑制。

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